Bu çalışmada hipersalin çevrelerden mikrofungus izolasyonu ve bu fungusların
Alkol Dehidrogenaz (ADH) enzimi açısından taranması amaçlanmıştır. İlaveten seçilen
verimli izolatlardan klonlama çalışmaları yapılarak endüstriyel üretime geçişi
sağlayacak verilerin ortaya konması hedeflenmiştir.
Bu amaçla, Tuz Gölü’nden alınan su örneklerinden mikrofungus izolasyonu
gerçekleştirilmiştir. Mikrofunguslar diagnostik literatürler kullanılarak geleneksel
yöntemler ile cins seviyesinde tanımlanmıştır. Dokuz cinse (Alternaria, Aspergillus,
Cladosporium, Emericella, Eurotium, Penicillium, Scopulariopsis, Stemphylium ve
Ulocladium) ait toplam 51 mikrofungus izole edilmiştir. İzolatların büyük bir kısmının
sırasıyla Cladosporium, Penicillium, Alternaria ve Aspergillus cinslerine ait olduğu
belirlenmiştir.
38 izolat için ADH enzim aktivitesi taraması yapılmıştır. En yüksek aktivite
saptanan 8 izolatın ITS (içsel transkrip ayırıcı) bölgeleri dizilenerek moleküler
yöntemlerle tanımlamaları yapılmıştır. En yüksek spesifik aktivite sırasıyla
Cladosporium macrocarpum (5776), Eurotium niveoglacum (5778), Aspergillus
versicolor (T55), A. niger (5800), C. sphaerospermum (5821), C. cladosporioides
(5794), Penicillium chrysogenum (5797) ve E. amstelodami (5810) türlerinde
saptanmıştır. Bu türler için spesifik enzim aktivitesi 3,21-5,93 U/mg arasında
değişmektedir.
Alkol dehidrogenaz gen bölgesi klonlama çalışmaları için E. amstelodami, P.
chrysogenum ve A. niger seçilmiştir. pJET1.2/blunt vektör klonlama plazmidi olarak
kullanılmış ve bakteryal transformansyon için E. coli EZ kompotent hücreleri ile
çalışılmıştır. Söz konusu gen bölgesinden farklı gen bölgelerinin klonlanması üzerine
enzim varlığını ortaya koymak için A. niger (5800) izolat özütüne amonyum sülfatla
çöktürme ve diyaliz yöntemleri uygulanmıştır. Enzim spesifik aktivitesi ham özüte göre
yaklaşık 20 kat artmıştır. Hücre özütü diyalizatında proteinlerin varlığının ve
profillerinin ortaya konması için SDS-PAGE ve HPLC yönteminden faydalanılmıştır.
In this study, focused on isolation of microfungi from hipersaline environment
and screening of their ADH activity. In addition, intended to reveal of the data for
provide the progression to the industrial production by cloning studies on selected
active isolates.
For this purpose, microfungi were isolated from Tuz Gölü water samples. The
microfungi were identified at genus level according to traditional identification
literatures. Totally 51 microfungi was isolated relating to nine genera (Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Emericella, Eurotium, Penicillium, Scopulariopsis,
Stemphylium and Ulocladium). Respectively isolates determined belonged to genera
order of Cladosporium, Penicillium, Alternaria ve Aspergillus.
ADH enzyme activity screening was carried out for 38 isolates. Eight isolates
with the highest activity were identified by molecular methods with sequencing of
internal transcribe spacer (ITS) regions. The highest specific activity determined on the
following species; Cladosporium macrocarpum (5776), Eurotium niveoglacum (5778),
Eurotium niveoglacum (5778), Aspergillus versicolor (t55), A. niger (5800), C.
sphaerospermum (5821), C. cladosporioides (5794), ), Penicillium chrysogenum (5797)
ve E. amstelodami (5810). Specific enzyme activity of these species ranged from 3.21
to 5.93 U / mg.
E. amstelodami, P. chrysogenum ve A. niger were selected for cloning studies.
pJET1.2/blunt vector was used as a cloning plasmid and for bacterial transformation
were studied with E. coli EZ competent cells. Due to cloning of different gene regions
instead of interested gene, ammonium sulfate precipitation and dialysis methods applied
to extract of A. niger (5800) for establish the presence of the enzyme. Enzyme specific
activity increased approximately 20-fold compared to the crude extract. SDS-PAGE ve
HPLC method was used to indicate the presence of proteins and protein profiles in
dialyzed cell extract.
