RNA interferans (RNAi) mekanizması aracılığıyla gen ve protein
ekspresyonunu düzenleyen mikroRNA’lar (miRNA) protein kodlamayan
endojen RNA’lardır. miRNA’lar hücre çoğalması, farklılaşma ve apoptozu
da içeren çeşitli biyolojik fonksiyonlarla ilişkilidirler. Bu nedenle kanseri de
içine alan çeşitli hastalıklarda önemli rol oynarlar. Onkogen ya da tümör
baskılayıcı olarak işlev görebilen miRNA’ların karsinogenezde de önemli rol
oynadığı bilinmektedir. Son yıllarda, tümör mikroçevresinde bulunan
stromal hücrelerin tümörle ilişkili hücrelere benzer özellik kazandıkları
bildirilmiştir. Ayrıca, tümör mikroçevresinden salgılanan inflamatuar
sinyallerin tümör büyümesini ve sürekliliğini teşvik ettiği düşünülmektedir.
Kanserlerin moleküler temelinin daha iyi anlaşılması ile yeni
belirteçlerin keşfedilmesini sağlamak, prognozunu belirlemek ve sonuç
olarak yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek amacıyla miRNA’ların
fonksiyonlarının ayrıntılı olarak incelenmesi gerekmektedir. Bu nedenlerle,
gerçekleştirilen çalışmada kanser hücreleri ile sağlıklı ve malign meme
dokusundan elde edilen stromal hücrelerin ortak kültürlerinde birbirleri
üzerine gösterdiği etkiler ve bu olası etkilerde miRNA’ların rolünü
araştırmayı amaçladık.
Bu amaçla, sağlıklı ve malign meme dokularından enzimatik sindirme
yöntemiyle stromal hücreler izole edildikten sonra uygun koşullarda
kültüre edildi. Sonrasında bu hücrelerin akım sitometri aygıtı ve
farklılaştırma çalışmaları ile karakterizasyon işlemleri gerçekleştirildi.
İmmunofenotipik özellikleri belirlenen sağlıklı ve malign meme
dokusundan elde edilen stromal hücreler kanser hücre hattı ile yarı
geçirgen membranlar (insert; ara bölüm) aracılığıyla ortak-kültüre edildi.
Ortak-kültür sonrası deney gruplarının çoğalım kapasiteleri WST-1 testi ile
değerlendirildi, ek olarak hücrelerin miRNA’ları izole edilip cDNA’ları
sentezlendi ve meme kanserine özel miRNA’lar (miR-27, miR-17-5p, miR-
21, miR-10b, miR-373, miR-520c, let7, mir-200) ve bu miRNA’lar ile
ilişkilendirilen genlerin ifade seviyeleri gerçek zamanlı PCR ile kantitatif
olarak belirlendi. Ayrıca kültür sonrasında süpernatantlara salınan bazı
sitokin ve kemokinlerin (IL-6, IL-1β, IL-8) seviyelerini belirlemek amacıyla
ELISA yöntemi uygulandı.
Gerçekleştirilen deneyler neticesinde malign stromal hücrelerin ortak
kültür sonrasında kanser hücrelerinin çoğalım kapasitelerini arttırdığını
saptadık. Ayrıca meme kanseri ile ilişkili olarak onkogenik ve tümör
baskılayıcı özellikte oldukları bilinen bir takım miRNA (miR-21, miR-17,
let-7 vb.) ve onların hedefledikleri genlerin (HMGA2, AIB1, PDCD4 vb.)
ifade seviyelerinde malign hücrelerle ortak kültür sonrasında
mikroçevrenin kanser oluşumunda önemli olduğunu destekler nitelikte
değişimler saptadık.Sonuç olarak, sağlıklı ve malign meme dokusu stromal hücrelerinin
parakrin mekanizmalar ile kanser hücrelerinde meydana getireceği
değişimlerde miRNA’lar ve onlarla ilişkilendirilen yolaklara özgü genlerin
olası rolleri gösterilmeye ve bu bağlamda tümör mikroçevresinin
tümörogenezdeki etkileri ayrıntılı şekilde ortaya konulmaya çalışılmıştır.
MicroRNAs (miRNAs) are endogenous non-coding RNAs which
regulate gene and protein expression through the RNA interference (RNAi)
mechanism. miRNAs are related to different biological functions including
cellular proliferation, differentiation and apoptosis. Therefore, they play
crucial roles in different diseases including cancer. Oncogene or tumor
suppressor miRNAs play an important role in tumorigenesis. It has been
reported that stromal cells in tumor microenvironment gained similar
features of tumor-associated cells. Additionally, it is considered that
inflammatory signals secreted from tumor microenvironment support
tumor growth and survivability.
Detailed analysis of miRNA functions should be investigated to
discover novel markers and to determine the prognosis through better
understanding of molecular basis of cancer concept, and to develop new
treatment approach consequently. Thus in the current study, we aimed to
investigate the effects of co-culture of cancer cells and stromal cells,
isolated from normal and malign breast tissues, on each others, and the
possible effects of miRNAs in these cross-effects.
Subsequently after isolation of stromal cells tissue by enzymatic
digestion method, appropriate culture condition will be maintained, and
flow-cytometry will be applied for the characterization. Characterized
stromal cells that are derived from normal and malign breast tissue will
co-cultured with MDA-MB-231 cancer cell line in the presence of semipermeable
membranes. After the co-culture, proliferation capacity of the
experimental groups were evaluated with WST-1 assay. Additionally RNAs
and miRNAs of the cancer and stromal cells will isolate and cDNAs will
synthesized. Expression levels of breast cancer specific miRNAs and
related genes will be evaluated by real-time PCR. Additionally after the coculture,
ELISA test will be performed to determine some of cytokine and
chemokine (IL-6,IL-1β,IL-8) levels secreted to supernatants.
As a result of experiments we found that increased proliferation
capacity of the cancer cells after co-culture with malignant stromal cells.
Also we found that microenvironment is important in the formation of
cancer in support of the changes in the expression levels of oncogenic and
tumor suppressor miRNA and their targeted genes after the co-culture
with malignant stromal cells.
As a conclusion, the possible roles of miRNAs on the alterations in
cancer cells by paracrine mechanisms of both normal and malign breast
tissues stromal cells are attempt to reveal. In the result of the performed
studies with this aim, specific gene expressions of related pathways are going to be detected correlated with miRNA changes, and the effects of
the tumor microenvironment in tumorogenesis will be revealed in detail.
