85% of stroke cases that can cause death or permanent damage in individuals
are caused by ischemia due to arterial occlusion or insufficient perfusion. In the
brain, ischemia and subsequent reperfusion processes trigger various
pathophysiological processes including excitotoxicity, periinfarct depolarization,
inflammation, nitric oxide production, free radical damage and cell death. Ischemia
reperfusion (I/R) processes in the brain trigger two apoptosis pathways, the
extrinsic pathway and the intrinsic pathway. Recent studies have shown that
necroptosis is also functional in ischemia reperfusion injury.
Pannexin 1 (Pan1) channels formed by Pan1 proteins have a wide
permeability specificity including cations, anions, secondary messengers and
metabolites. It is involved in various pathological processes such as cell
differentiation, tissue development and regeneration, inflammation and cell death.
Opening of Pan1 channels in brain ischemia and reperfusion process is regulated
by various factors such as oxygen-glucose deprivation, high K + concentration in the
intercellular space. Opening of the Pan1 channels leads to hypoxic depolarization,
which can result in cell death.
In our study, two hours of ischemia with clamp insertion to the right arteria
carotis communis and 24-hour reperfusion processes after blood flow were
provided. Using pan caspase inhibitor Z-VAD-fmk and Pan1 protein/channel
inhibitor probenecid, the role of Pan1 protein in brain I / R injury in apoptosis and
necroptosis processes was investigated. To investigate the relationship between
Pan1 channels and apoptosis caspase 3, caspase 8 gene expressions and protein
levels and the relationship between Pan1 channels and necroptosis was evaluated
by RIP1, RIP3, MLKL gene expressions and protein levels. In addition, TNF-α, as
an inflammation marker and PARP for predictors of DNA damage and apoptosis
were determined. The accumulation of protein levels in tissues was determined by
immunohistochemical studies using caspase 3, caspase 8, RIPK3 and MLKL
vi
antibodies. I/R damage was evaluated macroscopically by TTC staining and
apoptosis rates were determined by TUNEL method.
As a result of the studies, it was determined that probenecid, which is a pan1
channel/protein inhibitor, decreases RIP1, RIP3, and MLKL gene expressions and
protein levels associated with necroptosis and caspase 3 and caspase 8 gene
expressions and protein levels associated with apoptosis in the ischemia reperfusion process It was also determined that Z-VAD-fmk did not have a
significant effect on TNF-α in brain I/R injury but intraperitoneal administration
of probenecid decreased TNF-α during I/R process. In addition, in our study, it was
determined that the most effectively application that inhibited inflammation in I/R
damage by decreasing TNF-α in brain tissues was the co-administration of
apoptosis inhibitor and Pan1 inhibitor. It was demonstrated that the application
that most effective administration for reducing the level of PARP protein in the
brain I/R damage is co-administration of pan-caspase inhibitor Z-VAD-fmk and
Pan1 protein/channel inhibitor probenecid. As a result of TUNEL studies, it was
determined that probenecid administration blocking Pan1 channels decreased the
percentage of increased apoptosis in I/R process in brain tissues but this reduction
was not as effective as Z-VAD-fmk administration.
In conclusion, we found that both apoptotic and necroptotic cells are seen in
brain ischemia and reperfusion process, and while the pan caspase inhibitor Z VAD-fmk was reduced to cell damage some degree; probenecid, a Pan1
protein/channel inhibitor, is an effective therapeutic agent in reperfusion injury by
significantly reducing cell damage. Our results demonstrated that Pan1 proteins
play an important role in I/R damage
Bireylerde ölüme ya da kalıcı hasara sebep olabilen inme olgularının %85’i
arteriyel tıkanma ya da yetersiz perfüzyon sonucunda oluşan iskemi kaynaklıdır.
Beyinde iskemi ve bunu takip eden reperfüzyon süreçleri eksitoksisite, periinfarkt
depolarizasyon, inflamasyon, nitrik oksit üretimi, serbest radikal hasarı ve hücre
ölümü olmak üzere çeşitli patofizyolojik süreçlerin tetiklenmesine sebep olur.
Beyinde iskemi reperfüzyon (İ/R) süreçleri ekstrinsik yolak ve intrinsik olmak
üzere iki apoptoz yolağını tetikler. Son yıllarda yapılan çalışmalarda iskemi
reperfüzyon hasarında nekroptozun da bu süreçte işlevsel olduğu ortaya
konulmuştur.
Panneksin 1 (Pan1) proteinleri tarafından oluşturulan Pan1 kanalları
katyonlar, anyonlar ikincil mesajcılar ve metabolitler de dahil olmak üzere geniş
bir geçirgenlik özgüllüğüne sahiptir. Hücre farklılaşması, doku gelişimi ve
rejenerasyonu, inflamasyon ve hücre ölümü gibi çeşitli patolojik süreçlerde görev
alır. Beyin iskemi ve reperfüzyon sürecinde Pan1 kanallarının açılması oksijen glikoz yoksunluğu, hücreler arası alanda yüksek K+ konsantrasyonu gibi çeşitli
faktörler tarafından düzenlenir. Pan1 kanallarının açılması hücrelerin ölümü ile
sonuçlanabilecek hipoksik depolarizasyona neden olur.
Çalışmamızda, sıçanlarda sağ arteria carotis communis’e klemp takılarak
oluşturulan iki saat iskemi ve sonrasında kan akımının sağlandığı 24 saatlik
reperfüzyon süreçlerinde pan kaspaz inhibitörü Z-VAD-fmk ve Pan1 protein/kanal
inhibitörü probenecid kullanarak, oluşan beyin İ/R hasarında Pan1 proteinin
apoptoz ve nekroptoz süreçlerindeki rolü araştırıldı. Yapılan uygulamalar
sonucunda elde edilen beyin dokusu örnekleri kullanılarak Paneksin1 kanallarının
apoptoz ile ilişkisinin belirlenmesi için kaspaz 3, kaspaz 8, nekroptoz ile ilişkisinin
belirlenmesi için RIP1, RIP3, MLKL gen ifadeleri ve protein düzeyleri belirlendi.
Ayrıca bu yolaklarla ilişkili olan inflamasyon belirteci olan TNF-α ve DNA hasarı
ve apoptoz belirleyicisi olan PARP protein düzeyleri belirlendi. Kaspaz 3, kaspaz 8,
iv
RIPK3 ve MLKL antikorları kullanılarak immünohistokimyasal çalışmalar
yapılarak protein düzeylerinin dokularda birikimi belirlendi. TTC boyama
yapılarak İ/R hasarı makroskobik olarak değerlendirilirken, TUNEL yöntemi ile
dokularda apoptoz oranları belirlendi.
Yapılan çalışmalar sonucunda, Pan1 kanal/protein inhibitörü olan
probenecidin iskemi reperfüzyon sürecinde apoptoz ile ilişkili olarak kaspaz 3 ve
kaspaz 8 nekroptozla ilişkili olan RIP1, RIP3 ve MLKL gen ifadelerini ve protein
düzeylerinin düşürdüğü belirlendi. Beyin İ/R hasarında Z-VAD-fmk, TNF-α
düzeyinde önemli bir etki oluşturmadığı fakat probenecidin intraperitoneal
uygulaması İ/R sürecinde artan TNF-α protein düzeyini azalttığı belirlendi. Ayrıca
çalışmamızda beyin dokularında TNF-α protein düzeyini en etkili şekilde azaltarak
İ/R hasarında oluşan inflamasyonu inhibe eden uygulamanın hem apoptoz
inhibitörü hem de Pan1 inhibitörünün birlikte uygulanması olduğu belirlendi.
Yaptığımız çalışmada beyinde oluşturulan İ/R hasarında PARP protein düzeyini
en etkili şekilde azaltan uygulamanın pan kaspaz inhibitörü Z-VAD-fmk ve Pan1
protein/ kanal inhibitörü olan probenecidin birlikte uygulaması olduğu
belirlenmiştir. TUNEL çalışmaları sonucunda Pan1 kanalarını bloke eden
probenecid uygulamasının beyin dokularında iskemi ve reperfüzyon sürecinde
artan apoptoz yüzdesini azalttığı fakat bu azaltışın Z-VAD-fmk uygulaması kadar
etkili olmadığı belirlendi.
Sonuç olarak, gerçekleştirilen beyin iskemi ve reperfüzyon sürecinde hem
apoptotik hem nekroptotik hücrelerin görüldüğü, İ/R sürecinde oluşan hücre
hasarlarını uygulanan pan kaspaz inhibitörü Z-VAD-fmk’nın bir dereceye kadar
azaltırken Pan1 protein/kanal inhibitörü olan probenecidin önemli düzeyde
azaltarak reperfüzyon hasarında etkili bir terapötik ajan olduğu ve Pan1
proteinlerinin İ/R hasarında önemli rol aldığı belirlendi
