Ovaryum kanserinde hücre içi kalsiyum değişimlerinin ultrayapısal olarak incelenmesi

Abstract

Bu çalışma kapsamında, ovaryum kanseri hücrelerinde (SKOV-3) fibronektine bağlı integrin aktivasyonunun ardından, hücre içi kalsiyum artışı ile ER stresi oluşturulmuş ve sonrasında muhtemel apoptotik etkiler araştırılmıştır. SKOV-3 hücrelerinde Tunikamisin (TN) konsantrasyonları ile hücre içi kalsiyum değişimleri Fluo-3 AM ve Rhod-2 AM boyaları kullanılarak akım sitometrisiyle ölçülmüştür. Hücrelerin 18 μM TN uygulaması sonrasında oluşturulan ER stresine bağlı apoptotik hücre ölümü Anneksin V / PI yöntemi ile sitokrom c ve Endo G proteinlerinin lokalizasyonu ise floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir. Ayrıca hücrelerdeki morfolojik değişimler geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile tespit edilmiştir. Fluo-3 AM ve Rhod-2 AM ile boyanan SKOV-3 hücrelerinin 18 μM TN inkübasyonu sonrasında sırasıyla sitoplazmik ve mitokondriyal Ca+2 artışının olduğu gözlenmiştir. Bu artışa bağlı olarak, SKOV-3 hücrelerinde % 11.38 oranında erken apoptoz ve % 10.24 oranında geç apoptoz belirlenmiştir. Mitokondriyal kaynaklı apoptotik proteinler olan sitokrom c ve Endo G‟nin 2 saat TN inkübasyonlarında floresan ışımaların kaplamasız hücrelere oranla daha yoğun olduğu görülmüştür. Fibronektine bağlı SKOV-3 hücrelerinde ER stresine bağlı olarak gelişen apoptotik değişimler plazma ve çekirdek zarında bozulmalar, çekirdek kondensasyonu ve nükleusta fragmentasyona bağlı yoğun heterokromatin yapılar olarak belirmiştir. Sonuç olarak, metastatik aşamadaki (fibronektine bağlı) ovaryum kanseri hücrelerinde, kalsiyuma bağımlı apoptotik sürecin varlığı kısmen gösterilmiştir. Sonuçlar apoptotik sürecin izlenmesi ve integrin aktivasyonu ile etkilerin karşılaştırılması açısından literatüre katkı sağlayabilir, ayrıca ileri aşamada, ovaryum kanseri hücrelerinde apoptozu uyarıcı ya da hücre döngüsünü baskılayıcı inhibitör ve/veya ilaçların geliştirilmesi için de faydalı olabilir.

In this thesis, following the fibronectin-coated integrin activation in ovarian cancer cells (SKOV-3), endoplasmic reticulum stress was generated by intracellular calcium increase and then possible apoptotic effects were investigated. Tunicamycin (TN) concentrations and intracellular calcium alterations in SKOV-3 cells were analyzed by flow cytometry using Fluo-3 AM ve Rhod-2 AM flourescent dyes. Apoptotic cell death dependent to ER stress that generated after the treatment with 18 μM TN were investigated by Anneksin V / PI protocol and the localisations of cytocrome c and EndoG proteins were also imaged by fluorescent microscope. In addition, morphological alterations were determined by transmission electron microscope (TEM). Following the treatment with 18 μM TN of SKOV-3 cells staining with Fluo-3 AM ve Rhod-2 AM, cytoplasmic and mitochondrial Ca+2 increases were observed, respectively. Correspondingly, early apoptosis percentage was 11.38 % and late apoptosis percentage was 10.24% in SKOV-3 cells. After 2 hours TN incubations of mitochodrial apoptotic proteins cytocrome c and Endo G, flourescent radiations were found as more intense than non-coating cells. Apoptotic changes depending on ER stress in fibronectin coated SKOV-3 cells were determined as plasma and nucleus membrane damages, nucleus condensation and intense heterochromatin structures in nucleus by fragmentation. As a result, calcium dependent apoptotic process in ovarian cancer cells in metastatic stage were partially shown. The results obtained from this study may contribute to the literature in respect to integrin activation and comparison of effects, moreover, in an advanced stage, it would be useful for apoptosis induced or cell cycle supressed inhibitors and/or drugs development.